Golden Gate және Gibson Assembly арасындағы негізгі айырмашылық мынада: Golden Gate клондалатын белгілі бір реттілікте шектеу сайттарының болуына сүйенеді, ал Gibson Assembly белгілі бір реттіліктегі шектеу тораптарының болуына сенбейді. клондалады.
Соңғы онжылдықтарда молекулалық ғалымдар бірнеше ДНҚ фрагменттерін бір бөлікке оңай жинауға мүмкіндік беретін әртүрлі стандартталған процедураларды әзірледі. Сондықтан рестрикциялық ферментті байланыстыру, шлюзді клондау, Гибсон ассамблеясы, Алтын қақпа жинағы және TOPO клондау сияқты клондау әдістерін зерттеушілер ғылыми тәжірибелерде кеңінен қолданады. Сондықтан, Golden Gate және Gibson Assembly бірнеше ДНҚ фрагменттерін бір бөлікке жинауға мүмкіндік беретін екі молекулалық клондау әдісі болып табылады.
Алтын қақпа ассамблеясы дегеніміз не?
Алтын қақпа – бірнеше ДНҚ фрагменттерін бір бөлікке жинауды жеңілдететін молекулалық клондау әдісі. Бұл әдіс клондалатын белгілі бір реттілікте шектеу тораптарының болуына негізделген. Ол 1996 жылы шыққан. Бұл әдіс IIS типті шектеу ферменттері мен T4 ДНҚ лигазасын пайдаланады. Бұл ферменттер ДНҚ-ны тану орындарынан тыс кесіп тастайды. Олар палиндромдық емес асқынуларды жасай алады. Сондықтан ДНҚ-ның бірнеше фрагменттерін асқын тізбектердің комбинациялары арқылы жинауға болады.
01-сурет: Алтын қақпа
Алтын қақпаны жинау процедурасы
Алтын қақпа техникасының процедурасында үш негізгі қадам бар:
- клондау векторында асып кетулер жасау,
- сабақтардағы фрагментке тән реттіліктерді пайдалану арқылы бірнеше ДНҚ кірістірулерін құрастыру және
- лигация.
Golden Gate жинағы дөңгелек клондау векторларын пайдаланады (тағайындалған вектор). Сонымен қатар, бұл әдісте ас қорыту мен байлауды бір уақытта жүзеге асыру үшін байланыстырылған өнімнен шектеу орны жойылады. Golden Gate үшін әдеттегі термиялық цикл протоколы 37 °C және 16 °C арасында тербеледі, себебі 37 °C шектеу ферменттері үшін оңтайлы, ал 16 °C лигазалар үшін оңтайлы.
Гибсон Ассамблеясы дегеніміз не?
Gibson Assembly – бірнеше ДНҚ фрагменттерін бір бөлікке жинауға мүмкіндік беретін молекулалық клондау әдісі. «Алтын қақпа» әдісінен айырмашылығы, бұл әдіс клондалатын белгілі бір тізбектегі шектеу тораптарының болуына сүйенбейді. Оны Дж. Крейг Вентер институтының қызметкері Дэниел Гибсон тапты. Бұл әдіс реттілік пен лигазадан тәуелсіз клондау (SLIC) әдісінің бір түрі.
02-сурет: Гибсон жинағы
Гибсон құрастыру процедурасы
Гибсон ассамблеясына іргелес ДНҚ фрагменттерімен қабаттасатын 20-40 негіз жұбы бар ДНҚ фрагменттері қажет. Қабаттасулар ПТР арқылы қосылады. Содан кейін бұл ДНҚ фрагменттері үш ферменті бар Гибсон мазер қоспасына қосылады. Бұл процедура үш түрлі ферменттер: экзонуклеаза, ДНҚ полимераза және ДНҚ лигаза арқылы изотермиялық жағдайда (1 сағат бойы 50 °C) жүзеге асырылады. Экзонуклеаза ДНҚ-ны 5' ұшынан кері шайнайды. Осылайша, ол полимераза белсенділігін тежемейді және реакцияның бір процесте жүруіне мүмкіндік береді. Көршілес ДНҚ фрагменттеріндегі алынған бір тізбекті аймақтар қабаттасу реттіліктеріне байланысты күйдірілуі мүмкін. ДНҚ полимераза нуклеотидтерді қосу арқылы бос орындарды толтырады. Ақырында, ДНҚ лигазасы көрші сегменттердің ДНҚ-сына ковалентті түрде қосылады. Әдетте, Gibson Assembly сызықтық тағайындалған векторларды пайдаланады. Сонымен қатар, бұл әдіс реттілік ұқсастығына негізделген 15 ДНҚ фрагментіне дейін бір уақытта біріктіре алады.
Алтын қақпа мен Гибсон Ассамблеясының ұқсастықтары
- Алтын қақпа және Гибсон ассамблеясы - екі молекулалық клондау әдісі.
- Екі әдіс те бірнеше ДНҚ фрагменттерін бір бөлікке жинай алады.
- Бұл әдістер тағайындау векторларын пайдаланады.
- Екі әдіс те бірнеше ДНҚ фрагменттерін құрастыру үшін термиялық циклдерді пайдаланады.
- Олар сайтқа бағытталған мутагенезде қолданылады.
Алтын қақпа мен Гибсон ассамблеясының арасындағы айырмашылық
Алтын қақпа – бірнеше ДНҚ фрагменттерін бір бөлікке құрастыруда қолданылатын молекулалық клондау әдісі, ол клондалатын белгілі бір реттілікте шектеу орындарының болуына негізделген, ал Гибсон Ассамблеясы – молекулалық клондау әдісі. бірнеше ДНҚ фрагменттерін клондалатын белгілі бір реттілікте шектеу орындарының болуына сүйенбестен бір бөлікке жинақтау. Бұл Алтын қақпа мен Гибсон ассамблеясының негізгі айырмашылығы. Сонымен қатар, Golden Gate әдісі айналмалы тағайындау векторын пайдаланады, ал Гибсон құрастыру әдісі сызықтық тағайындау векторын пайдаланады.
Келесі инфографика Golden Gate және Gibson Assembly арасындағы айырмашылықты көрсетеді.
Қорытынды – Golden Gate және Gibson Assembly
Молекулалық клондау – рекомбинантты ДНҚ молекулаларын құрастыру және олардың қожайын организмдер ішінде репликациясын бағыттау үшін қолданылатын әдіс. Golden Gate және Gibson Assembly - бұл бірнеше ДНҚ фрагменттерін бір бөлікке жинауға мүмкіндік беретін екі молекулалық клондау әдісі. «Алтын қақпа» әдісі клондалатын белгілі бір реттілік ішінде шектеу тораптарының болуына негізделеді, ал Гибсон Ассамблеясы клондалатын белгілі бір тізбектегі шектеу тораптарының болуына сенбейді. Осылайша, бұл Golden Gate және Gibson Assembly арасындағы негізгі айырмашылық.
