Негізгі айырмашылық – Солтүстік пен Оңтүстік пен Батыс Блтинг
ДНҚ, РНҚ және белоктардың белгілі бір тізбегін анықтау Молекулалық биологиядағы әртүрлі зерттеулер түрлері үшін өте маңызды. Гель электрофорезі – ДНҚ, РНҚ және белоктарды өлшемдеріне қарай бөлетін әдіс. Гель профильдерінен белгілі бір ДНҚ тізбегі, РНҚ тізбегі немесе ақуыз белгіленген зондтармен тазарту және будандастыру деп аталатын арнайы әдістермен анықталады. Үш түрлі әдіс бар, олар оңтүстік, солтүстік және батыс. Солтүстік оңтүстік және батыс блтинг арасындағы негізгі айырмашылық үлгіден анықтайтын молекуланың түріне байланысты. Southern blotting - бұл ДНҚ үлгісінен белгілі бір ДНҚ тізбегін анықтайтын әдіс. Northern blotting - бұл РНҚ үлгісінен белгілі бір РНҚ тізбегін анықтайтын әдіс. Вестерн блотинг - ақуыз үлгісінен белгілі бір ақуызды анықтайтын әдіс.
Southern Blotting дегеніміз не?
Оңтүстік блтинг әдісін 1975 жылы ДНҚ үлгісінен нақты ДНҚ тізбегін анықтау үшін E. M. Southern әзірлеген. Бұл молекулярлық биологияда енгізілген бірінші блтинг әдісі. Бұл ДНҚ-дан нақты гендерді, ДНҚ-дан нақты фрагменттерді және т.б. анықтауға мүмкіндік берді. Southern blotting техникасында бірнеше қадамдар бар. Олар келесідей.
- ДНҚ үлгіден бөлініп, рестрикциялық эндонуклеазалармен қорытылады.
- Серітілген үлгі агароза гелі электрофорезі арқылы бөлінеді.
- Гельдегі ДНҚ фрагменттері сілтілі ерітіндіні қолдану арқылы бір жіптерге денатурацияланады.
- Бір тізбекті ДНҚ капиллярлық тасымалдау арқылы нитроцеллюлоза сүзгі мембранасына тасымалданады.
- Трансферттелген ДНҚ мембранаға біржолата бекітіледі.
- Мембранадағы бекітілген ДНҚ таңбаланған зондтармен будандастырылған.
- Байланбаған ДНҚ мембранадан жуу арқылы жуылады.
- Рентген пленкасы мембранаға шығарылады және авторрадиограф дайындалады.
Оңтүстік блтинг молекулалық биологияның әртүрлі аспектілері үшін қолданылады. Ол RFLP картасын жасауда, криминалистикалық зерттеулерде, ген экспрессиясында ДНҚ метилденуінде, генетикалық бұзылыстарда мутацияланған гендерді анықтауда, ДНҚ саусақ ізін алуда және т.б. пайдалы.
01-сурет: Southern Blotting Technique
Northern Blotting дегеніміз не?
Northern blotting – ген экспрессиясын зерттеу үшін үлгідегі белгілі бір РНҚ тізбегін немесе мРНҚ тізбегін анықтауға арналған әдіс. Бұл әдісті 1979 жылы Альвайн, Кемп және Старк әзірледі. Ол бірнеше қадамдарға байланысты оңтүстік және батыстық тазарту әдістерінен ерекшеленеді. Дегенмен, бұл әдіс арнайы таңбаланған зондтармен және анықтаумен гельдік электрофорез, тазарту және будандастыру арқылы да орындалады. Northern blotting техникасы келесідей орындалады.
- РНҚ үлгіден алынады және гельдік электрофорез арқылы бөлінеді.
- РНҚ гельден тазартқыш мембранаға тасымалданады және бекітіледі.
- Мембрана cDNA немесе РНҚ-дан дайындалған таңбаланған зондпен өңделеді (зонд үлгідегі белгілі бір тізбекті толықтырады).
- Зонд белгілі бір ретпен байланысу үшін мембранамен инкубацияланады.
- Байланбаған зондтар жуылады.
- Гибридтелген фрагменттерді авторрадиограф анықтайды.
Northern blotting гибридтенген мРНҚ-ны анықтау және сандық анықтау, РНҚ деградациясын зерттеу, РНҚ жартылай ыдырау кезеңін бағалау, РНҚ сплайсингін анықтау, ген экспрессиясын зерттеу және т.б. маңызды құрал болып табылады.
02-сурет: Northern Blotting
Western Blotting дегеніміз не?
Вестерн-блотинг – таңбаланған антиденені қолдану арқылы ақуыз қоспасынан белгілі бір ақуызды анықтау әдісі. Сондықтан western blot иммуноблот ретінде де белгілі. Бұл әдісті 1979 жылы Towbin және т.б. енгізген және қазір ол ақуызды талдау үшін зертханаларда жүйелі түрде орындалады. Қадамдар келесідей.
- Белоктар үлгіден алынған
- Белоктар полиакриламидті гель электрофорезі арқылы өлшемдері бойынша бөлінеді
- Бөлінген молекулалар электропорация арқылы PVDF мембранасына немесе нитроцеллюлоза мембранасына тасымалданады
- Мембрана антиденелермен спецификалық емес байланысу үшін блокталған
- Трансферттелген белоктар бастапқы антиденелермен (ферментпен белгіленген антиденелер) байланысады.
- Мембрана спецификалық емес байланысқан бастапқы антиденелерді жою үшін жуылады
- Байланысқан антиденелер субстрат қосу және түзілген түсті тұнбаны анықтау арқылы анықталады
Вестерн блотинг адам сарысуының үлгісінде ВИЧ-ке қарсы антиденелерді анықтауда пайдалы. Вестерн блотты В гепатиті инфекциясын растау және жынды сиыр ауруын анықтау үшін де қолдануға болады.
03-сурет: Western Blotting
Солтүстік Оңтүстік пен Батыс Блотингтің айырмашылығы неде?
Солтүстік пен Оңтүстік пен Вестерн Блотинг |
|
| Молекула түрі анықталды | |
| Northern Blotting | Northern blotting РНҚ үлгісінен белгілі бір РНҚ тізбегін анықтайды. |
| Оңтүстік Блотинг | Оңтүстік блоттинг ДНҚ үлгісінен белгілі бір ДНҚ тізбегін анықтайды. |
| Western Blotting | Western blotting ақуыз үлгісінен белгілі бір ақуызды анықтайды. |
| Гель түрі | |
| Northern Blotting | Бұл үшін агароза/формальдегид гелі қолданылады. |
| Оңтүстік Блотинг | Бұл үшін агароза гелі қолданылады. |
| Western Blotting | Бұл үшін полиакриламидті гель қолданылады. |
| Блотинг әдісі | |
| Northern Blotting | Бұл капиллярлық тасымалдау. |
| Оңтүстік Блотинг | Бұл капиллярлық тасымалдау. |
| Western Blotting | Бұл электрлік аударым. |
| Қолданылған зондтар | |
| Northern Blotting | cDNA немесе РНҚ зондтары радиоактивті немесе радиоактивті емес деп белгіленген. |
| Оңтүстік Блотинг | ДНҚ зондтары радиоактивті немесе радиоактивті емес деп белгіленген. |
| Western Blotting | Зонд ретінде бастапқы антиденелер пайдаланылады. |
| Анықтау жүйесі | |
| Northern Blotting | Бұл авторадиография немесе жарық немесе түс өзгерісін анықтау арқылы жасалады. |
| Оңтүстік Блотинг | Бұл авторадиография, жарық немесе түс өзгерісін анықтау арқылы жасалады. |
| Western Blotting | Бұл жарық немесе түс өзгерісін анықтау арқылы жасалады. |
Қорытынды – Солтүстік пен Оңтүстік пен Батыс Блоттинг
Блотинг - үлгілерден нақты ДНҚ, РНҚ немесе ақуызды анықтау үшін әзірленген арнайы әдіс. Белгілі бір молекула түрін анықтау үшін солтүстік, оңтүстік және батыс сияқты үш бөлек тазарту процедурасы бар. Northern blotting әдісі РНҚ қоспасынан белгілі бір РНҚ тізбегін анықтауға арналған. Southern blotting әдісі ДНҚ үлгісінен белгілі бір ДНҚ тізбегін анықтауға мүмкіндік береді, ал western blotting әдісі ақуыз қоспасынан белгілі бір ақуызды анықтау үшін әзірленген.
