Негізгі айырмашылық – SYBR Green және Taqman
SYBR Green және Taqman - нақты уақыттағы ПТР күшейту процесін анықтау немесе бақылау үшін қолданылатын екі әдіс. SYBR Green - бұл нуклеин қышқылымен бояудың интеркалирлеуіне негізделген әдіс, ал Такман - гидролиз зондына негізделген әдіс. Екі технология да ПТР кезінде флуоресценцияны генерациялауға арналған, бұл нақты уақыттағы ПТР аппаратына реакцияны «нақты уақытта» бақылауға мүмкіндік береді. SYBR Green әдісі SYBR жасыл деп аталатын флуоресцентті бояуды қолдану арқылы жүзеге асырылады және бояғышты өндірілген қос тізбекті ДНҚ-ға байланыстыру арқылы күшейтуді анықтайды. Такман екі таңбалы зондтарды қолдану арқылы жүзеге асырылады және зондты Taq полимеразамен деградациялау және флюорофор шығару арқылы күшейтуді анықтайды. Бұл SYBR Green және Taqman арасындағы негізгі айырмашылық.
SYBR Green дегеніміз не?
SYBR Green - нуклеин қышқылдарын, әсіресе молекулалық биологиядағы қос тізбекті ДНҚ-ны бояу үшін қолданылатын флуоресцентті бояғыш. SYBR Green әдісі нақты уақыттағы ПТР кезінде ПТР өнімдерінің санын анықтау үшін қолданылады. ДНҚ-мен байланысқаннан кейін пайда болған ДНҚ-бояғыш кешені көк жарықты жұтып, қарқынды жасыл жарық шығарады. Бұл екі тізбекті ДНҚ-мен байланысқан кезде бояғыш молекуласында болатын құрылымдық өзгеріске байланысты болады. ПТР барған сайын көбірек ДНҚ жасағанда, көбірек бояғыш молекулалары ДНҚ-мен байланысып, көбірек флуоресценция тудырады. Сондықтан флуоресценция ПТР өнімінің жинақталуымен артады. Демек, ПТР өнімінің мөлшерін SYBR Green флуоресценция анықтау арқылы сандық түрде өлшеуге болады.
SYBR жасыл бояуын цитометрия мен флуоресцентті микроскопияда ДНҚ таңбалау үшін де пайдалануға болады. Этидий бромиді SYBR жасылымен сәтті ауыстырылды, өйткені этидиум бромиді гель электрофорезінде ДНҚ визуализациясы кезінде жойылу проблемалары бар канцерогенді бояғыш болып табылады.
SYBR жасыл әдісінің артықшылықтары мен кемшіліктері бар. Бұл әдіс өте сезімтал, арзан және пайдалану оңай. Дегенмен, кез келген қос тізбекті ДНҚ-мен байланысу қабілетіне байланысты спецификалық емес байланысу ПТР өнімін шамадан тыс сандық анықтауға әкелуі мүмкін.
01-сурет: SYBR Green Technique
Тақман дегеніміз не?
Такман - нақты уақыттағы ПТР процесін бақылау үшін SYBR Green әдісіне балама әдіс. Бұл әдіс жаңа тізбектің ұзаруы және флюорофордың бөлінуі кезінде зондтарды бұзу үшін Taq полимераза ферментінің 5’ – 3’ экзонуклеаза белсенділігіне байланысты. Бұл әдісте қос таңбалы зондтар қолданылады және ол зондтардың гидролизіне негізделген. Зондтар флуоресцентті таңбаланған ДНҚ олигонуклеотидтері болып табылады, 5' ұшында флуоресцентті репортер молекуласы (флюорофор) және 3' ұшында сөндіргіш молекуласы бар. Олар праймер жасытуларының қарама-қарсы жағындағы бір жіпті шаблонды байланыстыруға арналған. Taq полимераза праймерге нуклеотидтерді қосады және жаңа тізбекті қос таңбаланған зондтарға қарай ұзартады. Taq полимеразасы зондпен кездескенде, Taq полимеразасының экзонуклеазалық әрекеті зондты белсендіреді және нашарлатады. Жаңа тізбектің синтезін аяқтағаннан кейін зонд толық деградацияға ұшырап, фторфорды босатады. Флуорофордың бөлінуі флуоресценцияны тудырады. Флуоресцентті сөндіргіш молекуласы шығарылатын жарықты тиімді түрде сөндіреді және ПТР өнімінің сандық көрсеткіштерін жасайды. Флюорофорлардың бөлінуі және ПТР өнімдерінің саны пропорционалды. Демек, сандық анықтауды тақман әдісімен оңай жасауға болады.
02-сурет: Такман әдісі
Такман әдісі нақты уақыттағы ПТР, ген экспрессиясын сандық анықтау, генетикалық полиморфизмді анықтау, хромосомалық ДНҚ делециясын анықтау, бактериялық идентификация, микромассив анализін тексеру, SNP генотипін анықтау және т.б. пайдаланылады.
SYBR жасылы мен тақманның айырмашылығы неде?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green ДНҚ байланыстыратын бояуға негізделген. | Такман гибридтеу зондтарына және Taq полимеразасының 5'-3' экзонуклеаза белсенділігіне байланысты. |
| Флуоресцентті таңбаланған зондтар | |
| Флуоресцентті таңбаланған зондтар қажет емес. | Қос таңбалы зондтар қажет. |
| Мультиплексті гендік талдау | |
| Оны мультиплекстік гендік мақсаттар үшін пайдалану мүмкін емес. | Оны мультиплекстік гендік мақсаттар үшін пайдалануға болады. |
| Құны | |
| Бұл арзанырақ. | Бұл қымбатырақ. |
| ерекшелік | |
| Бұл ерекше емес және кез келген қос тізбекті ДНҚ-мен байланысады | Зондтар арнайы күшейту өнімдерін анықтайтындықтан, бұл өте ерекше. |
| Тиімділік | |
| Бұл тиімді емес. | Бұл өте тиімді. |
| Қолданба | |
| Бұл нақты уақыттағы ПТР, агарозды гель визуализациясы, ДНҚ таңбалауы және т.б. пайдаланылады. | Бұл нақты уақыттағы ПТР, ген экспрессиясының сандық көрсеткіштері, генетикалық полиморфизмдерді анықтау және т.б. пайдаланылады. |
Қорытынды – SYBR Green және Taqman
Такман және SYBR жасыл - нақты уақыттағы ПТР (сандық ПТР) кезінде қолданылатын екі әдіс. Екі әдіс те ПТР өнімінің мөлшерін тиімді анықтауға мүмкіндік береді және флуоресценцияның эмиссиясына сүйенеді. Такман әдісі жинақталған ДНҚ-ны анықтау үшін қос таңбалы зондтарды пайдаланады, ал SYBR Green әдісі флуоресцентті бояуды пайдаланады. Бұл екі әдістің де молекулалық биологияда әртүрлі қолданылуы бар.
