Негізгі айырмашылық – Сангер реттілігі мен Пиросеквенирлеу
ДНҚ секвенциясы ДНҚ талдауы үшін өте маңызды, өйткені белгілі бір ДНҚ аймағындағы нуклеотидтердің дұрыс орналасуын білу ол туралы көптеген маңызды ақпаратты ашады. ДНҚ секвенирлеудің әртүрлі әдістері бар. Сэнгер секвенирлеу және Пиросеквенирлеу - бұл молекулалық биологияда кеңінен қолданылатын екі түрлі ДНҚ секвенирлеу әдісі. Сэнгер секвенирлеуі мен Пиросеквенирлеу арасындағы негізгі айырмашылық мынада: Сэнджер секвенциясы нуклеотидтер тізбегін оқу үшін ДНҚ синтезін тоқтату үшін дидеоксинуклеотидтерді пайдаланады, ал пиросквенирлеу нуклеотидтерді қосу және комплементарлы тізбекті оқу ретін синтездеу арқылы пирофосфаттың бөлінуін анықтайды.
Sanger Sequencing дегеніміз не?
Сэнгер секвенциясы 1977 жылы Фредерик Сэнгер және оның колледждері әзірлеген бірінші буын ДНҚ секвенирлеу әдісі болып табылады. Ол сондай-ақ тізбекті аяқтау реттілігі немесе дидеокси секвенциясы ретінде белгілі, өйткені ол дидеоксинуклеотидтермен (ddNTPs) тізбекті тоқтатуға негізделген. Бұл әдіс Жаңа ұрпақ тізбегі (NGS) жасалғанға дейін 30 жылдан астам уақыт бойы кеңінен қолданылды. Сэнгер секвенирлеу әдісі нуклеотидтердің дұрыс ретін табуға немесе белгілі бір ДНҚ фрагментін бекітуге мүмкіндік берді. Ол in vitro ДНҚ репликациясы кезінде ddNTP-тердің селективті қосылуына және ДНҚ синтезін тоқтатуға негізделген. Көршілес нуклеотидтер арасындағы фосфодиэфирлік байланыстың түзілуін жалғастыру үшін 3' OH топтарының болмауы ddNTPs бірегей ерекшелігі болып табылады. Демек, ddNTP қосылғаннан кейін тізбектің ұзаруы тоқтайды және осы нүктеден аяқталады. Sanger секвенирлеуінде төрт ddNTP қолданылады – ddATP, ddCTP, ddGTP және ddTTP. Бұл нуклеотидтер ДНҚ-ның өсіп келе жатқан тізбегіне қосылған кезде ДНҚ репликация процесін тоқтатады және қысқа ДНҚ-ның әртүрлі ұзындықтарына әкеледі. Капиллярлық гель электрофорезі 01-суретте көрсетілгендей осы қысқа ДНҚ жіптерін гельдегі өлшемдері бойынша ұйымдастыру үшін қолданылады.
1-сурет: Синтезделген қысқа ДНҚ капиллярлық гель электрофорезі
ДНҚ-ның in vitro репликациясы үшін бірнеше талаптарды қамтамасыз ету керек. Олар ДНҚ-полимераза ферменті, шаблон ДНҚ, олигонуклеотидті праймерлер және дезоксинуклеотидтер (dNTP). Сэнгер секвенирлеуінде ДНҚ репликациясы төрт бөлек сынақ түтікшелерінде және ddNTP төрт түрі бөлек орындалады. Дезоксинуклеотидтер сәйкес ddNTP-мен толығымен ауыстырылмайды. Белгілі бір dNTP қоспасы (мысалы, dATP + ddATP) түтікке кіреді және қайталанады. Төрт бөлек түтік өнімдері төрт бөлек ұңғымадағы гельде іске қосылады. Содан кейін гельді оқу арқылы ретті 02-суретте көрсетілгендей құруға болады.
02-сурет: Сангер реттілігі
Сэнджер реттілігі молекулалық биологияның көптеген салаларында көмектесетін маңызды әдіс болып табылады. Адам геномының жобасы Сэнгер секвенциясы негізіндегі әдістердің көмегімен сәтті аяқталды. Сэнгер секвенциясы мақсатты ДНҚ секвенциясы, қатерлі ісік және генетикалық ауруларды зерттеу, ген экспрессиясын талдау, адамды идентификациялау, патогенді анықтау, микробтарды секвенирлеу, т.б. үшін пайдалы.
Sanger реттілігінің бірнеше кемшіліктері бар:
- Тізбектелетін ДНҚ ұзындығы 1000 негізгі жұптан ұзағырақ болуы керек
- Бір уақытта тек бір жолды ретке келтіруге болады.
- Процесс көп уақытты және қымбатты.
Сондықтан уақыт өте келе бұл мәселелерді шешу үшін жаңа жетілдірілген реттілік әдістері әзірленді. Дегенмен, шамамен 850 негізгі жұп ұзындығы фрагментіне дейінгі жоғары дәлдіктегі нәтижелерге байланысты Sanger секвенциясы әлі де қолданылуда.
Пиросеквенирлеу дегеніміз не?
Пиросеквенирлеу – «синтез арқылы секвенирлеуге» негізделген ДНҚ секвенциясының жаңа әдісі. Бұл әдіс нуклеотидтердің қосылуы кезінде пирофосфаттың бөлінуін анықтауға негізделген. Процесті төрт түрлі фермент қолданады: ДНҚ-полимерза, АТФ сульфурилаза, люцифераза және апираз және екі субстрат аденозин 5' фосфосульфат (APS) және люциферин.
Процесс бір тізбекті ДНҚ үлгісімен праймерді байланыстырудан басталады және ДНҚ полимераза оған комплементарлы нуклеотидтердің қосылуын бастайды. Нуклеотидтер біріктірілгенде (нуклеин қышқылының полимерленуі) ол пирофосфат (бір-бірімен байланысқан екі фосфат тобы) топтары мен энергияны бөледі. Әрбір нуклеотид қосылуы пирофосфаттың эквимолярлы мөлшерін шығарады. Пирофосфат АПС субстратының қатысуымен АТФ сульфурилаза арқылы АТФ-қа айналады. Жасалған АТФ люцифераза арқылы люцифериннің оксилуциферинге айналуын басқарады, АТФ мөлшеріне пропорционал мөлшерде көрінетін жарық шығарады. Жарық фотонды анықтау құрылғысы немесе фотокөбейткіш арқылы анықталады және пирограмма жасайды. Апираза реакция қоспасында АТФ және қосылмаған dNTP-ны ыдыратады. dNTP қосу бір уақытта орындалады. Нуклеотидтің қосылуы жарықтың қосылуы мен анықталуына сәйкес белгілі болғандықтан, шаблонның реттілігін анықтауға болады. Пирограмма 03-суретте көрсетілген ДНҚ үлгісінің нуклеотидтер тізбегін генерациялау үшін пайдаланылады.
Пиросеквенирлеу бір нуклеотидті полиморфизмді талдауда және ДНҚ-ның қысқа созылуларының секвенирлеуінде өте маңызды. Жоғары дәлдік, икемділік, автоматтандырудың қарапайымдылығы және параллельді өңдеу - Пиросеквенирлеудің Sanger секвенирлеу әдістерінен артықшылығы.
03-сурет: Пиросеквенирлеу
Sanger Sequencing және Pyrosequencing арасындағы айырмашылық неде?
Санджер реттілігі және пиросеквенирлеу |
|
| Сэнджер секвенциясы – ДНҚ полимеразасы арқылы ddNTP-терді таңдамалы түрде біріктіруге және тізбекті тоқтатуға негізделген ДНҚ секвенирлеу әдісі. | Пиросеквенирлеу – нуклеотид қосылған кезде пирофосфаттың бөлінуін анықтауға негізделген ДНҚ секвенирлеу әдісі. |
| ddNTP пайдалану | |
| ddNTPs ДНҚ репликациясын тоқтату үшін пайдаланылады | ddNTP пайдаланылмайды. |
| Қатысқан ферменттер | |
| ДНҚ-полимераза қолданылады. | Төрт фермент қолданылады: ДНҚ-полимераза, АТФ сульфурилаза, люцифераза және апираз. |
| Қолданылған субстраттар | |
| APS және Люциферин пайдаланылмайды. | Аденозин 5' фосфосульфат (APS) және люциферин қолданылады. |
| Ең жоғары температура | |
| Бұл баяу процесс. | Бұл жылдам процесс. |
Қорытынды – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Сэнджер секвенциясы және Пиросеквенирлеу молекулалық биологияда қолданылатын ДНҚ секвенирлеудің екі әдісі болып табылады. Сэнгер секвенирлеуі тізбектің ұзаруын тоқтату арқылы нуклеотидтердің ретін ретпен құрастырады, ал пиросеквенирлеу нуклеотидтердің қосылуы және пирофосфаттардың бөлінуін анықтау арқылы нуклеотидтердің нақты тәртібін дәйектілікпен құрады. Сондықтан, Sanger секвенирлеуі мен Пиросеквенирлеу арасындағы негізгі айырмашылық мынада: Sanger секвенциясы тізбекті аяқтау арқылы секвенирлеу бойынша жұмыс істейді, ал пирожаттығу синтез арқылы секвенирлеу бойынша жұмыс істейді.
