Негізгі айырмашылық – Максам Гилберт пен Сангер секвенциясы
Нуклеотидтер ДНҚ-ның негізгі құрылымдық бірліктері және құрылыс блоктары болып табылады. ДНҚ молекуласы полинуклеотидтік тізбектен тұрады. ДНҚ-да төрт түрлі нуклеотид бар. Бұл нуклеотидтер А (аденин), G (гуанин), С (цитозин), Т (тимин) деп аталатын төрт түрлі азотты негізден тұрады. ДНҚ молекуласындағы нуклеотидтердің реті үлкен маңызға ие, өйткені ол организмдердің өсуі мен дамуы үшін маңызды генетикалық ақпаратты кодтайды. ДНҚ секвенциясы ДНҚ-ның нақты нуклеотидтер тізбегін анықтайтын процесті білдіреді. ДНҚ секвенирлеудің әртүрлі әдістері бар. Максам Гилберт секвенциясы және Сэнгер ДНҚ секвенциясы бірінші ұрпақ секвенциясына жататын ДНҚ секвенирлеудің екі әдісі болып табылады. Максам Гилберт секвенирлеу процедурасы төрт нуклеотидтің әрқайсысында және гельдік электрофорезде артықшылықты түрде 5' соңы таңбаланған ДНҚ фрагменттерін химиялық жолмен бөлу арқылы негізгі ретті анықтайды. Сэнгер секвенирлеу процедурасы ДНҚ-полимераза және дидеоксинуклеотидтер және гельдік электрофорез арқылы бір тізбекті ДНҚ синтезі арқылы нуклеотидтер тізбегін анықтайды. Бұл Максам Гилберт пен Сэнгер реттілігі арасындағы негізгі айырмашылық.
Максам Гилберт реттілігі дегеніміз не?
Максам Гилберт секвенциясы, сондай-ақ химиялық реттілік әдісі ретінде белгілі, ДНҚ-дағы нуклеотидтердің ретін анықтау үшін жасалған әдіс. Бұл әдісті 1976 жылы Уолтер Гилберт пен Алан Максам енгізді және оны тазартылған ДНҚ арқылы тікелей орындауға болатындықтан танымал болды. Максам Гилберт әдісі ДНҚ секвенирлеудің бірінші буынына жатады және бұл ғалымдар кеңінен қолданатын бірінші секвенирлеу әдісі болды.
Бұл әдістің негізгі принципі нақты негіздердегі соңғы таңбаланған ДНҚ фрагменттерін негізге тән химиялық заттармен және шарттармен шектеу және 01-суретте көрсетілгендей таңбаланған фрагменттерді электрофорез арқылы бөлу болып табылады. Фрагменттерді бөлу гельдегі олардың өлшемдері бойынша. Фрагменттер таңбаланғандықтан, ДНҚ молекуласының ретін оңай шығаруға болады.
Максам Гилберт әдісі ДНҚ-ны белгілі бір негіздерде бұзу үшін негізгі арнайы химиялық заттарды пайдаланады. Диметилсульфат және гидразин деп аталатын екі жалпы химиялық зат тиісінше пуриндер мен пиримидиндерге селективті түрде әсер ету үшін пайдаланылады.
Максам Гилберт реттілігі әдісі келесідей бірнеше қадамдар арқылы орындалады.
- Регистрациялық эндонуклеазаларды қолдану арқылы ДНҚ тізбегін тазарту
- Радиактивті фосфаттарды қосу арқылы ДНҚ фрагменттерінің ұштарын таңбалау
- Таңбаланған фрагменттерді таңбаланбаған фрагменттерден гельдік электрофорез арқылы тазарту
- Соңында таңбаланған ДНҚ-ны төрт түтікке бөлу және негізгі арнайы химиялық заттармен бөлек өңдеу
- Әр түтіктің мазмұнын гельдегі бөлек сызықтардағы электрофорез және олардың ұзындығына қарай фрагменттерді бөлу.
- Фрагменттерді авторадиография арқылы анықтау.
01-сурет: Максам Гилберт реттілігі
Sanger Sequencing дегеніміз не?
Sanger Sequencing - берілген ДНҚ фрагментінің негізгі реттілігін анықтау үшін 1977 жылы Фредерик Сэнгер және оның әріптестері әзірлеген секвенирлеу әдісі. Ол сондай-ақ тізбекті аяқтау реттілігі немесе Дидеокси секвенирлеу әдісі ретінде белгілі. Бұл әдіс тізбек түзілуін тоқтату үшін бір тізбекті ДНҚ синтезі кезінде ДНҚ-полимераза арқылы ddGTP, ddCTP, ddATP және ddTTP сияқты тізбекті аяқтайтын дидеоксинуклеотидтерді (ddNTPs) таңдамалы біріктіру принципі бойынша жұмыс істейді. Дидезоксинуклеотидтерде іргелес нуклеотидпен фосфодиэфирлік байланыстардың түзілуі үшін 3' OH топтары жоқ. Демек, ddNTP сангер секвенирлеуі кезінде жаңадан түзілетін тізбекке қосылғаннан кейін жіп түзілуі тоқтайды.
Бұл әдісте төрт бөлек ДНҚ синтез реакциясы (ПТР) ddNTP бір түрі бар төрт бөлек түтікте орындалады. ПТР үшін түтіктерге арналған басқа талаптар, соның ішінде праймерлер, dNTPs, Taq полимераза, арнайы шарттар және т.б. беріледі. Төрт қоспасы бар төрт түтікте төрт бөлек реакция орындалады. ПТР реакцияларынан кейін алынған ДНҚ фрагменттері жылумен денатурацияланады және гельдік электрофорез арқылы бөлінеді. Содан кейін фрагменттер 02-суретте көрсетілгендей таңбаланған (радиоактивті немесе флуоресцентті) праймер немесе dNTP көмегімен бейнеленеді.
02-сурет: Сангер реттілігі
Максам Гилберт пен Сэнгер реттілігінің айырмашылығы неде?
Максам Гилберт пен Сэнгер реттілігі |
|
| Максам Гилберт секвенциясы - ДНҚ секвенциясы үшін жасалған бірінші әдіс. | Сэнжер реттілігі әдісі Максам Гилберт реттілік әдісінен кейін енгізілді. |
| Қолдану | |
| Бұл әдіс сирек қолданылады. | Санджер реттілігі реттілік үшін әдеттегідей пайдаланылады. |
| Қауіпті химиялық заттарды пайдалану | |
| Ол қауіпті химиялық заттарды пайдаланады. | Максам Гилберт әдісімен салыстырғанда қауіпті химиялық заттарды пайдалану шектелген. |
| Анықтау үшін таңбалау | |
| Бұл әдіс ДНҚ фрагменттерінің ұштарын таңбалау үшін радиоактивті P32 пайдаланады. | Sanger реттілігі радиоактивті немесе флуоресцентті таңбаланған ddNTPs пайдаланады. |
Қорытынды – Максам Гилберт пен Сэнгер реттілігі
Максам Гилберт және Сэнгер секвенциясы - бірінші ұрпақтың ДНҚ секвенциясына сәйкес келетін ДНҚ секвенирлеу әдістерінің екі түрі. Максам Гилберт секвенциясы 1976 жылы ДНҚ секвенциясы үшін енгізілген бірінші әдіс болып табылады және ол негізге тән химиялық заттар арқылы соңғы таңбаланған ДНҚ фрагменттерін бұзу арқылы орындалады. Демек, ол химиялық реттілік ретінде белгілі. Sanger секвенирлеу әдісі 1977 жылы енгізілген және ddNTP басқарылатын тізбекті тоқтату реакцияларына негізделген. Сэнгер секвенирлеу әдісі Максам Гилберт әдісінен көп уақытты тұтыну, қауіпті химиялық заттарды пайдалану және т.б. сияқты Максам Гилберт әдісінің бірнеше кемшіліктеріне байланысты танымал. Бұл Максам Гилберт пен Сэнгер реттілігі арасындағы айырмашылық.
