Негізгі айырмашылық – RT PCR және QPCR
Полимеразды тізбекті реакция - in vitro ДНҚ-ның белгілі бір аймағын күшейту үшін қолданылатын әдіс. Бұл техниканы 1983 жылы Кари Муллис ойлап табуының арқасында ғалымдар зерттеу мақсатында нақты ДНҚ фрагменттерінің мыңнан миллионға дейінгі көшірмелерін жасай алды. Қазіргі уақытта ол клиникалық және ғылыми-зерттеу зертханаларында қолданудың кең ауқымы үшін әдеттегі және жүйелі түрде орындалатын әдіске айналды. RT ПТР, кірістірілген ПТР, мультиплексті ПТР, Q ПТР, RT – QPCR және т.б. сияқты дәстүрлі ПТР техникасының нұсқалары бар. RT ПТР және Q ПТР – ПТР-ның екі маңызды нұсқасы. RT ПТР мен Q ПТР арасындағы негізгі айырмашылық мынада: RT ПТР РНҚ-дан комплементарлы ДНҚ (cDNA) транскрипттерін жасау арқылы ген экспрессиясын анықтау үшін қолданылады, ал Q ПТР флуоресцентті бояғыштар арқылы нақты уақытта ПТР өнімдерін сандық өлшеу үшін қолданылады.
RT ПТР дегеніміз не?
кері транскрипциялық полимеразды тізбекті реакция (RT ПТР) РНҚ экспрессиясын анықтау үшін қолданылатын ПТР нұсқасы болып табылады. Бұл тіндердегі мРНҚ экспрессиясын анықтаудың өте маңызды әдісі. RT ПТР үлгінің бастапқы материалы РНҚ болған кезде қолданылады. RT ПТР-де үлгі мРНҚ алдымен комплементарлы ДНҚ-ға айналады. Бұл қадам кері транскриптаза ферментімен катализденеді және процесс кері транскрипция деп аталады. Екіншіден, күшейту үшін жаңадан синтезделген cDNA үшін дәстүрлі ПТР қолданылады.
RT ПТР – РНҚ үлгісінің салыстырмалы түрде аз мөлшерін қажет ететін өте сезімтал әдіс. RT ПТР әдетте РНҚ түрлерін, әсіресе адамның иммун тапшылығы вирусы және С гепатиті вирусы сияқты РНҚ вирустарын диагностикалау және сандық анықтауда қолданылады.
01-сурет: RT ПТР техникасы
QPCR дегеніміз не?
Сандық ПТР (QPCR) – ПТР өнімдерін сандық өлшеу үшін қолданылатын ПТР нұсқасы. Ол сондай-ақ нақты уақыт режиміндегі полимеразды тізбекті реакция деп аталады, өйткені ол нақты уақыттағы ПТР машинасының көмегімен нақты уақыттың күшейтілуін өлшейді. Бұл үлгідегі мақсатты тізбектің немесе геннің мөлшерін анықтауға қолайлы әдіс. QPCR қызық ерекшелігі ол күшейтуді де, шынайы сандық анықтауды да бір қадамға біріктіреді. Сондықтан анықтауда гельдік электрофорез қажеттілігін QPCR әдісі арқылы жоюға болады. QPCR ПТР реакциялары кезінде ПТР өнімдерін таңбалау үшін флуоресцентті бояғыштарды пайдаланады, бұл ақырында тікелей сандық анықтауға әкеледі. ПТР өнімдері жинақталғанда, флуоресцентті сигналдар да жинақталады және ол нақты уақыт машинасымен өлшенеді. QPCR RT ПТР-мен біріктірілуі мүмкін. Ол RT – QPCR немесе QRT – ПТР ретінде белгілі және жасушалардағы немесе тіндердегі РНҚ деңгейін анықтаудың ең күшті, сезімтал және сандық әдісі ретінде қарастырылады.
SYBR Green және Taqman - нақты уақыттағы ПТР күшейту процесін анықтау немесе бақылау үшін қолданылатын екі әдіс. SYBR Green әдісі SYBR жасыл деп аталатын флуоресцентті бояу арқылы жүзеге асырылады және қос тізбекті ДНҚ алу үшін бояуды байланыстыру арқылы күшейтуді анықтайды. Такман екі таңбалы зондтарды қолдану арқылы жүзеге асырылады және 02-суретте көрсетілгендей Taq полимераза арқылы зондтың ыдырауы және флюорофордың бөлінуі арқылы күшейтуді анықтайды. Екі әдіс те күшейту процесінің барысын бақылайды және нақты уақытта өнімнің санын хабарлайды..
Нақты уақыттағы ПТР ген экспрессиясын сандық анықтау, микроРНҚ және кодталмаған РНҚ талдауы, SNP генотиптеу, көшірме санының нұсқаларын анықтау, сирек мутацияларды анықтау, генетикалық түрлендірілген ағзаларды анықтау, инфекциялық агенттерді анықтау сияқты көптеген қолданбаларға ие., т.б.
02-сурет: Сандық ПТР әдісі
RT ПТР мен QPCR арасындағы айырмашылық неде?
RT ПТР және QPCR |
|
| RT ПТР – күшейту арқылы ген экспрессиясын анықтау үшін қолданылатын әдіс. | QPCR – нақты уақытта ДНҚ-ны күшейтетін және ПТР өнімдерінің санын анықтайтын әдіс. |
| кері транскриптаза ферментінің қатысуы | |
| Кері транскриптаза ферменті RT ПТР үшін пайдаланылады. | Кері транскриптаза ферменті QPCR үшін пайдаланылмайды. |
| Флуоресцентті таңбаланған молекулаларды пайдалану | |
| Флуоресцентті таңбаланған бояғыштар немесе зондтар RT ПТР үшін пайдаланылмайды. | QPCR үшін флуоресцентті таңбаланған бояғыштар немесе зондтар пайдаланылады. |
| ПТР өнімінің сандық көрсеткіші | |
| QPCR қосылмаса, RT ПТР ПТР өнімінің сандық көрсеткішін көрсетпейді. | QPCR ПТР өнімін сандық түрде өлшеңіз. |
| Бастау материалы | |
| Бастапқы материал – мРНҚ. | Бастапқы материал - ДНҚ. |
| cDNA синтезі | |
| Комплементарлы ДНҚ RT ПТР кезінде жасалады. | Қосымша ДНҚ QPCR кезінде жасалмайды. |
Қорытынды – RT ПТР және QPCR
RT ПТР және QPCR дәстүрлі ПТР екі нұсқасы болып табылады. RT ПТР әдісі мРНҚ үлгілері үшін орындалады және ол кері транскрипция мен кДНҚ өндірісі арқылы жүзеге асырылады. QPCR флуоресцентті бояғыштарды немесе таңбаланған зондтарды пайдалана отырып, нақты уақыттағы ПТР термиялық циклдері кезінде ПТР өнімдерінің санын анықтау үшін қолданылады. QPCR жүйесінде ПТР өнімінің мөлшері үлгі бойынша шығарылатын флуоресцентті сигналдармен көрсетіледі. RT ПТР күшейту процесі ретінде кеңінен қолданылады, ал QPCR әдетте сандық процесс ретінде қолданылады. Бұл RT ПТР мен QPCR арасындағы айырмашылық.
