Негізгі айырмашылық – нитроцеллюлоза мен PVDF
Western blotting - ақуыз үлгісінен нақты ақуыздарды анықтауға және сандық анықтауға мүмкіндік беретін әдіс. Техниканың сенімділігі гельден ақуыздарды сіңіру үшін дұрыс мембрананы таңдауға байланысты. Микрокеуекті мембраналардың әртүрлі түрлері бар. Нитроцеллюлоза және PVDF мембраналары - бұл мембраналардың басқа түрлеріне қарағанда ерекше атрибуттарына байланысты зерттеушілер таңдаған екі мембрана. Нитроцеллюлоза немесе PVDF арасындағы таңдау, сондай-ақ вестерн блтингтегі тағы бір қиындық. Нитроцеллюлоза да, PVDF де ақуызды сіңіру қабілеті жоғары. Нитроцеллюлоза мен PVDF мембранасының негізгі айырмашылығы - нитроцеллюлоза мембраналарының антиденелерді ажырату және антиденелерді жою үшін мембрананы қайта пайдалану мүмкіндігі жоқ, ал PVDF мембраналарында тазарту және қайта пайдалану мүмкіндігі бар.
Нитроцеллюлоза дегеніміз не?
Нитроцеллюлоза – целлюлозаны азот қышқылымен өңдеу арқылы өндірілген полимер және молекулалық биологияда микрокеуекті мембраналар жасау үшін, әсіресе оңтүстік, солтүстік және батыс блтинг сияқты тазалау әдістері үшін қолданылады. Нитроцеллюлоза мембраналарының кеуектері 3-тен 20 мкм-ге дейін ауытқиды. Нитроцеллюлозаның микрокеуекті мембраналары мембрана бетінде болатын иммунохимиялық реакцияны анықтауды жеңілдетеді. Сондықтан нитроцеллюлоза мембраналары белоктарды иммобилизациялау және вестерн-блотта арнайы ақуыздарды анықтау үшін жиі қолданылады. Нитроцеллюлоза мембраналары гликопротеиндер мен нуклеин қышқылдарын да иммобилизациялай алады.
Нитроцеллюлоза мембраналары бүйірлік ағынды талдауда бірнеше ерекшеліктерге байланысты таңдалады. Нитроцеллюлоза мембраналары ақуыздарды жоғары концентрацияда сіңіреді. Мембрананы сулау үшін қолданылатын еріткіш нитроцеллюлоза мембранасының ақуызды сіңіруін төмендетпейді. Нитроцеллюлоза мембраналарын қажетті гель өлшеміне оңай кесуге болады және ақуыздарды гельден мембранаға электрлік немесе капиллярлық тасымалдау арқылы тасымалдауға болады. Нитроцеллюлоза жоғары байланыстыру потенциалы бар мембрана арқылы ақуыздардың жылдам өтуіне мүмкіндік береді. Нитроцеллюлоза өңдеудің жақсартылған күшін көрсетеді. Нитроцеллюлоза мембранасының тағы бір ерекше қасиеті - оны ерітпейтін суға төзімді желімдермен әртүрлі пластикалық тіректерге оңай жабыстыруға болады.
01-сурет: western blotting үшін нитроцеллюлоза мембранасы
PVDF дегеніміз не?
Поливинилидендифторид (PVDF) – винилиден дифторидінің полимерленуі нәтижесінде алынатын фторполимер және ақуыздарды иммобилизациялау қабілеті жоғары. Сондықтан, PVDF-тен жасалған микрокеуекті мембраналар белоктар қоспаларынан белгілі бір ақуыздарды талдау үшін вестерн блтинг техникасында қолданылады. PVDF мембраналарын аминқышқылдарын талдау және ақуызды секвенирлеу үшін де пайдалануға болады. Нитроцеллюлоза мембранасының үстіндегі PVDF мембранасының ең маңызды сипаттамасы оның антиденелерді оңай жұлып алуы және келесі антидене зондтары үшін қайта пайдалануға болатындығы болып табылады.
PVDF мембраналары нитроцеллюлоза мембраналарына қарағанда қалыңырақ; демек, қайта пайдалану кезінде зақымдануға төзімдірек. PVDF мембраналары жоғары гидрофобты болып табылады. Сондықтан оларды қолданар алдында метанолға немесе изопропанолға малынған жөн.
Нитроцеллюлоза мен PVDF арасындағы айырмашылық неде?
Нитроцеллюлоза және PVDF |
|
| Нитроцеллюлоза - целлюлозадан тұратын полимер. | PVDF – винилиден дифторидінің полимерленуі нәтижесінде алынған фторполимер. |
| Мембраналық тесік өлшемі | |
| Әдеттегі кеуектер өлшемдері 0,1, 0,2 немесе 0,45μ | Әдеттегі кеуектер өлшемдері 0,1, 0,2 немесе 0,45 мкм |
| Белоктарды байланыстыру сыйымдылығы | |
| Нитроцеллюлозаның ақуызды байланыстыру қабілеті 80-100 мкг/см2. | PVDF ақуызды байланыстыру қабілеті 170-200 мкг/см2. |
| Сезімталдық | |
| Бұл PVDF-пен салыстырғанда сезімталдығы төмен. | Бұл жоғары сезімталдыққа ие. |
| Төмен экспрессияланған белоктарды анықтау | |
| Нитроцеллюлоза мембраналарында сезімталдық төмен болғандықтан, ол аз экспрессияланған белоктарды анықтауға жарамайды. | Бұл жоғары сезімталдыққа байланысты аз экспрессияланған белоктарды анықтау үшін қолайлы. |
| Фондық шу | |
| Оның фондық шуы төмен | Бұл фондық шу жоғарырақ. |
| Белоктармен әрекеттесу | |
| Белок молекулалары гидрофобты әрекеттесу арқылы нитроцеллюлоза мембраналарымен байланысады. | Белоктар PVDF мембраналарымен гидрофобты және дипольді әрекеттесу арқылы байланысады. |
| Мембрананың табиғаты | |
| Нитроцеллюлоза сынғыш және нәзік. Дегенмен, нитроцеллюлозаның нұсқалары бар және олар төзімді. | PVDF берік және химиялық төзімділігі жоғары. |
| Ашу және қайта пайдалану мүмкіндігі | |
| Нитроцеллюлозада сигналды жоғалтпастан ажырату және қайта тексеру қиын болуы мүмкін. | PVDF қолданбаларды қайта тексеру және реттілік үшін өте қолайлы. |
| Жарамдылық | |
| Нитроцеллюлоза төмен молекулалы ақуыздарды анықтау үшін өте қолайлы. | PVDF жоғары молекулалық салмақты ақуыздарды анықтау үшін қолайлы. |
| Басқа пайдаланулар | |
| Нитроцеллюлозаны нуклеин қышқылын талдау және нүкте/саңылауларды тазалау үшін пайдалануға болады. | PVDF ақуызды секвенирлеу және қатты фазалық талдау жүйелері үшін пайдаланылуы мүмкін. |
| Құны | |
| Бұл PVDF мембраналарынан арзанырақ. | Бұл нитроцеллюлоза мембраналарына қарағанда қымбатырақ. |
| Алдын ала сулау қажет | |
| Нитроцеллюлоза мембраналары метанолмен алдын ала сулауды қажет етпейді | PVDF мембраналары метанолмен алдын ала сулауды қажет етеді. |
Қорытынды – Нитроцеллюлоза және PVDF
Нитроцеллюлоза мембраналары бүйірлік ағынды талдау үшін коммерциялық қолданылған алғашқы мембраналар болды. Олардың ақуыздарды сіңіру қабілеті жоғары. Сондықтан вестерн-блотингте нитроцеллюлоза мембраналары қолданылады. PVDF - бұл вестерн блтингте қолданылатын мембрананың тағы бір түрі және оның ақуызды сіңіру қабілеті жоғары. Екі түрі де белокты талдау үшін вестерн-блотингте қолданылады. Дегенмен, PVDF мембраналарының ерекше атрибуттары бар, бұл оларды нитроцеллюлоза мембраналарына қарағанда вестернді блоттау үшін қолайлы етеді. Бірақ нитроцеллюлоза мембраналары төмен молекулалық салмақты ақуыздарды анықтау үшін қолайлырақ, PVDF мембраналары жоғары молекулалық салмақты ақуыздарды анықтау үшін қолайлы. Бұл нитроцеллюлоза мен PVDF мембраналарының арасындағы айырмашылық.
