Негізгі айырмашылық – NGS және Сангер реттілігі
Next Generation Sequencing (NGS) және Sanger Sequencing - уақыт өте дамыған нуклеотидтерді реттілік техникасының екі түрі. Sanger Sequencing әдісі көптеген жылдар бойы кеңінен қолданылды және NGS өзінің артықшылықтарына байланысты оны жақында ауыстырды. NGS мен Sanger Sequencing арасындағы негізгі айырмашылық мынада: NGS бір уақытта секвенирлеу жүйесі арқылы миллиондаған реттіліктерді жылдам секвенирлеу принципі бойынша жұмыс істейді, ал Sanger Sequencing ДНҚ полимераза ферментімен дидеоксинуклеотидтердің селективті қосылуына байланысты тізбекті тоқтату принципінде жұмыс істейді. ДНҚ репликациясы және нәтижесінде фрагменттердің капиллярлық электрофорез арқылы бөлінуі кезінде.
Нуклеотидті реттілік дегеніміз не?
Генетикалық ақпарат ағзаның ДНҚ немесе РНҚ нуклеотидтер тізбегінде сақталады. Берілген фрагменттегі (гендегі, гендер кластерідегі, хромосомадағы және толық геномдағы) нуклеотидтердің дұрыс ретін (төрт негізді пайдалана отырып) анықтау процесі нуклеотидтердің реттілігі деп аталады. Геномдық зерттеулерде, криминалистикалық зерттеулерде, вирусологияда, биологиялық жүйелік, медициналық диагностикада, биотехнологияда және басқа да көптеген салаларда гендердің құрылымы мен қызметін талдау өте маңызды. Ғалымдар жасаған реттілік әдістерінің әртүрлі түрлері бар. Олардың ішінде 1977 жылы Фредерик Сэнгер әзірлеген Сэнгер секвенциясы келесі ұрпақ секвенциясы оны ауыстырғанға дейін ұзақ уақыт бойы кеңінен қолданылды және танымал болды.
NGS дегеніміз не?
Next Generation Sequencing (NGS) – заманауи жоғары өткізу қабілеттілігінің реттілік процестеріне сілтеме жасау үшін қолданылатын термин. Ол геномдық зерттеулер мен молекулярлық биологияда төңкеріс жасаған әр түрлі заманауи секвенирлеу технологияларының қатарын сипаттайды. Бұл әдістер Illumina реттілігі, Roche 454 секвенциясы, иондық протонды реттілік және SOLiD (Олиго лигациясын анықтау арқылы секвенирлеу) секвенциясы болып табылады. NGS жүйелері жылдамырақ және арзанырақ. NGS жүйелерінде ДНҚ секвенирлеудің төрт негізгі әдісі қолданылады, атап айтқанда; пиросеквенирлеу, синтез арқылы секвенирлеу, байлау және иондық жартылай өткізгіш секвенирлеу. ДНҚ немесе РНҚ тізбегінің үлкен саны (миллиондаған) параллельді реттелген болуы мүмкін. Ол көп уақытты қажет ететін Сангер секвенциясына қарағанда, организмдердің бүкіл геномын қысқа уақыт ішінде секвенирлеуге мүмкіндік береді.
NGS кәдімгі Сэнгер әдісімен салыстырғанда көптеген артықшылықтарға ие. Бұл шағын үлгі өлшемімен орындалуы мүмкін жоғары жылдамдықты, дәлірек және үнемді процесс. NGS метагеномикалық зерттеулерде, енгізулер мен жоюларға байланысты жеке геномдағы вариацияларды анықтауда және т.б. ген экспрессияларын талдауда қолданылуы мүмкін.
1-сурет: NGS секвенирлеуіндегі әзірлемелер
Sanger Sequencing дегеніміз не?
Sanger Sequencing - берілген ДНҚ фрагментінің нуклеотидтер ретін дәл анықтау үшін 1977 жылы Фредерик Сэнгер және оның әріптестері әзірлеген секвенирлеу әдісі. Ол сондай-ақ тізбекті аяқтау реттілігі немесе дидеоксидті реттілік ретінде белгілі. Бұл әдістің жұмыс принципі ДНҚ репликациясы кезінде ДНҚ полимераза арқылы ddGTP, ddCTP, ddATP және ddTTP сияқты тізбекті аяқтайтын дидеоксинуклеотидтерді (ddNTPs) таңдамалы түрде қосу арқылы тізбек синтезін тоқтату болып табылады. Қалыпты нуклеотидтерде жіп түзілуін жалғастыру үшін көрші нуклеотидтер арасында фосфодиэфирлік байланыстың түзілуі үшін 3' OH топтары болады. Дегенмен, ddNTP-лерде бұл 3' OH тобы жоқ және нуклеотидтер арасында фосфодиэфирлік байланыс түзе алмайды. Демек, тізбектің ұзаруы тоқтатылады.
Бұл әдісте тізбектелетін бір тізбекті ДНҚ in vitro ДНҚ синтезі үшін үлгілік тізбек ретінде қызмет етеді. Басқа талаптар олигонуклеотидті праймер, дезоксинуклеотид прекурсорлары және ДНҚ-полимераза ферменті болып табылады. Мақсатты фрагменттің бүйірлік ұштары белгілі болған кезде, праймерлерді ДНҚ репликациясына оңай жасауға болады. Төрт бөлек ДНҚ синтез реакциясы төрт бөлек түтікте орындалады. Әрбір түтікте басқа талаптармен бірге бөлек ddNTP бар. Нақты нуклеотидтен dNTP және ddNTP қоспасы қосылады. Сол сияқты төрт қоспасы бар төрт түтікте төрт бөлек реакция жүргізіледі. Реакциялардан кейін ДНҚ фрагменттерін анықтау және фрагмент үлгісін реттілік ақпаратына түрлендіру орындалады. Алынған ДНҚ фрагменттері жылумен денатурацияланады және гельдік электрофорез арқылы бөлінеді. Егер радиоактивті нуклеотидтер пайдаланылса, полиакриламидті гельдегі жолақ үлгісін авторрадиография арқылы көруге болады. Бұл әдіс флуоресцентті тегтелген дидеоксинуклеотидтерді пайдаланған кезде, оны гель деңгейіне дейін төмендетуге және флуоресцентті детектор арқылы анықтау үшін лазер сәулесі арқылы өткізуге болады. Тізімді көзбен оқып, компьютерге қолмен енгізу кезінде туындауы мүмкін қателерді болдырмау үшін бұл әдіс компьютермен біріктірілген автоматтандырылған секвенсерді пайдалануға әзірленді.
Бұл адам геномы жобасындағы ДНҚ ретін анықтау үшін қолданылатын әдіс. Бұл әдіс әлі де жетілдірілген модификациялармен қолданылуда, себебі ол қымбат және баяу процесс болғанына қарамастан дәл реттілік туралы ақпаратты береді.
2-сурет: Сангер реттілігі
NGS және Sanger Sequencing арасындағы айырмашылық неде?
NGS және Сангер реттілігі |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) заманауи жоғары өткізу қабілеттілігі секвенирлеу процестеріне жатады. Ол бірқатар әртүрлі заманауи реттілік технологияларын сипаттайды | Sanger Sequencing - берілген ДНҚ фрагментінің нуклеотидтер ретін дәл анықтау үшін Фредерик Сэнгер әзірлеген секвенирлеу әдісі. |
| Шығынның тиімділігі | |
| NGS арзанырақ процесс, себебі ол уақытты, адам күшін және химиялық заттарды азайтады. | Бұл қымбат процесс, себебі уақытты, адам күшін және көбірек химиялық заттарды қажет етеді. |
| Жылдам | |
| Бұл жылдамырақ, өйткені химиялық анықтау және көптеген жіптерді сигналды анықтау қатар жүреді. | Химиялық анықтау және сигналды анықтау екі бөлек процесс ретінде орындалатындықтан және бір уақытта тек жіпте оқи алатындықтан, бұл уақытты қажет етеді. |
| Сенімділік | |
| NGS сенімді. | Sanger реттілігі азырақ сенімді |
| Үлгі өлшемі | |
| NGS азырақ ДНҚ мөлшерін қажет етеді. | Бұл әдіс ДНҚ үлгісінің үлкен көлемін қажет етеді. |
| Бір реттелген фрагменттегі ДНҚ негіздері | |
| Бір реттелген фрагменттегі ДНҚ негіздерінің саны Сэнгер әдісінен аз | Жасау реті NGS тізбектерінен ұзағырақ. |
Қорытынды – NGS және Сангер реттілігі
NGS және Sanger Sequencing - молекулалық биологияда кеңінен қолданылатын нуклеотидтерді секвенирлеу әдістері. Sanger секвенциясы - NGS ауыстырылған ерте реттілік әдісі. NGS мен Sanger Sequencing арасындағы негізгі айырмашылық - NGS жоғары жылдамдықты, дәлірек және үнемді процесс. Екі әдіс те генетика мен биотехнологияда үлкен індет тудырды.
