Негізгі айырмашылық – генді клондау және ПТР
Нақты ДНҚ фрагментінен ДНҚ-ның көптеген көшірмелерін синтездеу ДНҚ күшейту деп аталады. ДНҚ күшейтудің екі негізгі процесі бар, атап айтқанда генді клондау және ПТР. Гендерді клондау мен ПТР арасындағы негізгі айырмашылық мынада: генді клондау рекомбинантты ДНҚ құру және қабылдаушы бактерияның ішінде өсу арқылы in vivo белгілі бір геннің бірнеше көшірмелерін жасайды, ал ПТР қайталанатын циклдардан өтетін in vitro нақты ДНҚ фрагментінің миллиондаған көшірмелерін шығарады. денатурация және синтез.
Генді клондау дегеніміз не?
Генді клондау – рекомбинантты ДНҚ құру арқылы организмнің экстрагирленген геномдық ДНҚ-сынан белгілі бір генді табу және көбейту үшін қолданылатын әдіс. Геномдық ДНҚ құрамында белоктар үшін кодталған мыңдаған әртүрлі гендер бар. ДНҚ алынған кезде ол көтере алатын барлық мүмкін гендерді қамтиды. Гендерді клондау әдісі жалпы ДНҚ-дан белгілі бір генді анықтауға мүмкіндік берді. Сондықтан гендерді клондау молекулалық биологияда маңызды құрал ретінде қызмет етеді.
Ағзаның геномдық кітапханасын жасау, егер ДНҚ-да тиісті геннің орны туралы мәлімет болмаса, гендерді клондау үшін өте маңызды. Геномдық кітапхана келесі қадамдар арқылы жасалады.
1-қадам: Қажетті гені бар ағзадан жалпы ДНҚ-ны алу.
2-қадам: Шағын басқарылатын фрагменттерді шығару үшін алынған ДНҚ қорытылуын шектеу. Бұл қадамды шектеу эндонуклеазалары жеңілдетеді.
3-қадам: сәйкес векторды таңдау және бірдей шектеу эндонуклеазалары арқылы векторлық ДНҚ-ны ашу. Бактериялық плазмидалар әдетте бөгде ДНҚ тасымалдау үшін векторлар ретінде пайдаланылады. Плазмидалар - бактериялардың ішінде орналасқан ДНҚ-ның шағын шеңберлері.
4-қадам: рекомбинантты ДНҚ молекуласын алу үшін векторлық ДНҚ мен фрагменттелген ДНҚ-ны біріктіру. Бұл қадамды ДНҚ лигазасы басқарады.
5-қадам: Рекомбинантты ДНҚ молекулаларын хост бактерияларына тасымалдау. Бұл қадам түрлендіру деп аталады және жылу соққысы арқылы орындалады.
5-қадам: Қоректік ортадағы трансформацияланған бактерия жасушаларын скрининг. Трансформация процесінің соңында трансформацияланған және трансформацияланбаған хост жасушаларының аралас популяциясы алынады. Қызығушылық гені тек трансформацияланған хост жасушаларында болғандықтан. Демек, трансформацияланған жасушаларды таңдау керек. Таңдау антибиотиктерді қамтитын селективті ортаны пайдалану арқылы жүзеге асырылады. Таңдауға мүмкіндік беретін осы скринингтік ортада тек трансформацияланған ұяшықтар өседі.
6-қадам: гендік кітапхана жасау үшін бактерияларды өсіру. Бұл қадамда трансформацияланған хост жасушалары оңтайлы өсу талаптарын қамтамасыз ететін жаңа культура ортасына енгізіледі. Мәдени тақталардағы жалпы колониялар сол ағзаның геномдық кітапханасын білдіреді.
7-қадам: Қызықтыратын гені бар рекомбинантты ДНҚ молекуласы рекомбинантты ДНҚ-ның мыңдаған клондалған фрагменттерінен скринингтен өтуі керек. Оны белгілі бір генді немесе осы геннен алынған арнайы ақуыз нәтижелерін белгілейтін зондтарды пайдалану арқылы жасауға болады.
Бактерия колониясы бар мүдделі ген жалпы колониялардан анықталғаннан кейін, гені бар рекомбинантты плазмиданың миллиондаған көшірмелерін жасауға болады.
Генді клондау гендер кітапханасын құруда, арнайы ақуыз, витаминдер, антибиотиктер, гормондар өндіруде, организмдердің геномдарын секвенирлеуде және картаға түсіруде, сот сараптамасында жеке тұлғалардың ДНҚ-сының бірнеше көшірмелерін жасауда және т.б. үшін қолданылады.
1-сурет: гендерді клондау
ПТР дегеніміз не?
Полимеразды тізбекті реакция (ПТР) – белгілі бір ДНҚ фрагментінің көп көшірмелерін жасайтын әдіс. Белгілі бір ДНҚ тізбегін экспоненциалды күшейту in vitro жағдайында ПТР арқылы алынады. Бұл әдіс молекулярлық биологиядағы өте күшті құрал, өйткені ол ДНҚ-ның шағын үлгісін қолдануға болатын мөлшерге көбейте алады. ПТР әдісін 1983 жылы Кари Муллис енгізді және бұл жүлделі өнертабыс молекулалық биологияда үлкен жетістікке қол жеткізді.
ПТР әдісі 02-суретте көрсетілгендей қайталанатын ПТР реакцияларынан кейін жүзеге асырылады. Бір ПТР реакциясы үш түрлі температурада орын алатын үш негізгі қадамнан тұрады; 94 0C температурада ДНҚ-да қос тізбекті денатурациялау, 68 0C температурада праймерлерді күйдіру және 72 0 кезінде тізбекті ұзарту C. Сондықтан, ПТР жүргізілгенде, дұрыс репликация үшін температура ауытқуы жоғары деңгейде сақталуы керек. ПТР ПТР түтіктерінің ішіндегі ПТР аппаратында орындалады. ПТР түтіктеріне ДНҚ үлгісі, Taq полимеразасы, праймерлері, dNTP және буфері бар дұрыс ПТР қоспалары салынады. Қос тізбекті ДНҚ үлгісін бір тізбекті ДНҚ-ға денатурациялау 94 – 98 0C температурада комплементарлы негіздер арасындағы сутектік байланыстарды бұзу арқылы жүзеге асырылады. Содан кейін ДНҚ шаблонының бір тізбектері праймерлер үшін экспозицияланады. Праймерлер жұбын (алға және кері) қамтамасыз ету керек және олар жоғары температураға төзімді болу үшін термотұрақты болуы керек. Праймерлер – мақсатты ДНҚ фрагментінің ұштарын толықтыратын бір тізбекті қысқа ДНҚ тізбегі. ПТР-да синтетикалық праймерлер қолданылады. Праймерлер ДНҚ үлгісінің комплементарлы негіздерімен байланысып, жаңа тізбектің синтезін бастайды. Бұл қадам Taq полимераза деп аталатын ферментпен катализденеді; Thermus auqaticus оқшауланған термотұрақты ДНҚ-полимераза ферменті. Праймерлер мен нуклеотидтер (құрылыс блоктары) қол жетімді болғанда, Taq полимераза ДНҚ шаблонына қосымша ДНҚ-ның жаңа тізбегін құрастырады. ПТР бағдарламасының соңында гельдік электрофорез көмегімен күшейтілген ДНҚ фрагменті байқалады. Қосымша талдау қажет болса, ПТР өнімі гельден тазартылады.
ПТР генетикалық және жүре пайда болған ауруларды диагностикалау және бақылау, қылмыскерлерді анықтау (криминалистика саласында), ДНҚ-ның мақсатты сегментінің құрылымы мен қызметін зерттеу, организмдердің геномдарын секвенирлеу және картаға түсіру үшін өте пайдалы, т.б. ПТР ғалымдар арасында медициналық және молекулалық биология зерттеу зертханаларында әдеттегі зертханалық әдіске айналды, өйткені оның қолдану аясы кең.
2-сурет: полимеразды тізбекті реакция
Гендерді клондау мен ПТР арасындағы айырмашылық неде?
Генді клондау және ПТР |
|
| Генді клондау - рекомбинантты ДНҚ арқылы белгілі бір геннің in vivo бірнеше көшірмесін жасау және иесі бактерияға айналдыру процесі. | ПТР әдісі ПТР реакцияларының қайталанатын циклдары арқылы in vitro жағдайында белгілі бір ДНҚ тізбегінің бірнеше көшірмелерін жасайды. |
| Рекомбинантты ДНҚ құруға қойылатын талаптар | |
| Рекомбинантты ДНҚ генді анықтау үшін жасалады. | Рекомбинантты ДНҚ өндірілмейді. |
| Еңбекке мұқтаж | |
| Бұл процесс көп еңбекті қажет етеді. | Интенсивті еңбек қажет емес. |
| In vivo немесе In vitro процесс | |
| Рекомбинантты ДНҚ құрылысы in vitro және ДНҚ күшейтілуі in vivo. | ДНҚ-ның күшейтілуі толығымен in vitro жүреді. |
Қорытынды – Гендерді клондау және ПТР
Генді клондау және ПТР ДНҚ күшейту үшін қолданылатын екі әдіс. ПТР – рекомбинантты ДНҚ мен иесі ағзаны пайдаланбай белгілі бір ДНҚ фрагментінің ДНҚ-ның бірнеше көшірмелерін жасайтын in vitro процесс. Гендерді клондау, ең алдымен, рекомбинантты ДНҚ құру арқылы хост ағзаның ішінде мүдделі геннің бірнеше көшірмелерін алуға әкелетін in vivo процесс. Бұл генді клондау мен ПТР арасындағы айырмашылық.
