Кәдімгі кірістірілген және нақты уақыттағы ПТР талдауларының негізгі айырмашылығы мынада: кәдімгі ПТР – бұл ДНҚ-ның белгілі бір тізбегін күшейту үшін әзірленген әдіс және кірістірілген ПТР – бұл екі дәйекті күшейту реакциясынан тұратын кәдімгі ПТР модификациясы. -уақыттағы ПТР – күшейтілген өнімнің санын анықтауға қабілетті кәдімгі ПТР нұсқасы.
ПТР – ДНҚ анықтау үшін зерттеулер мен медицинада кеңінен қолданылатын өте кең таралған ғылыми әдіс. ПТР сынақтары антигендерді олардың ДНҚ немесе РНҚ анықтау арқылы анықтау үшін қолданылады. Әдетте, вирустық РНҚ антиденелерді анықтағанға дейін немесе аурудың белгілерін көрсетпес бұрын денеде болады. ПТР сынағы біреуде вирустың бар-жоғын ерте анықтауға болады. Қазіргі уақытта ПТР COVID-19 ауруын анықтауға арналған стандартты сынақ болып табылады. Нақты уақыттағы ПТР, кірістірілген ПТР, мультиплексті ПТР, ыстық бастау ПТР және ұзақ мерзімді ПТР, т.б. сияқты ПТР әдістерінің әртүрлі түрлері бар.
Кәдімгі ПТР талдаулары дегеніміз не?
Дәстүрлі ПТР талдауы – молекулалық биологиялық зертханаларда жүйелі түрде орындалатын in vitro ДНҚ күшейту әдісі. Бұл әдіс белгілі бір ДНҚ фрагментінің мыңдаған миллиондаған көшірмелерін жасауға мүмкіндік берді. Кари Муллис бұл әдісті 1980 жылы енгізді. Бұл әдіс көптеген көшірмелерді жасау үшін шаблон деп аталатын ДНҚ фрагментін қажет етеді. Taq полимераза ДНҚ-полимераза ферменті ретінде жұмыс істейді және үлгі тізбегінің жаңа тізбектерінің синтезін катализдейді.
ПТР қоспасындағы праймерлер фрагментті кеңейту үшін бастапқы нүкте ретінде жұмыс істейді. ДНҚ көшірмелерін жасауға қажетті барлық ингредиенттер ПТР қоспасына кіреді. ПТР реакциясы ПТР аппаратында орындалады және оны дұрыс ПТР қоспасымен және дұрыс ПТР бағдарламасымен беру керек. Егер реакция қоспасы мен бағдарлама дұрыс болса, ол ДНҚ-ның өте аз мөлшерінен ДНҚ-ның белгілі бір бөлігінің қажетті көшірмелерін шығарады.
01-сурет: Кәдімгі ПТР талдауы
ПТР реакциясында үш негізгі қадам бар: денатурация, праймерді жасыту және жіпті ұзарту. Бұл үш қадам үш түрлі температурада орын алады. ПТР буфері Taq полимераза әрекеті үшін оңтайлы жағдайларды сақтайды. ПТР реакциясының осы үш кезеңі ПТР өнімінің қажетті мөлшерін алу үшін қайталанады. Әрбір ПТР реакциясында ДНҚ көшірмелерінің саны екі есе артады. Демек, ПТР-да экспоненциалды күшейтуді байқауға болады. ПТР өнімін гель электрофорезі арқылы шешуге болады, өйткені ол гелде ДНҚ-ның көрінетін мөлшерін шығарады және оны секвенирлеу сияқты қосымша зерттеулер үшін тазартуға болады.
ПТР медициналық және биологиялық зерттеулердегі құнды құрал болып табылады. Әсіресе сот-медициналық зерттеулерде ПТР үлкен мәнге ие, өйткені ол қылмыскерлердің кішкентай үлгілерінен зерттеулер үшін ДНҚ-ны күшейтіп, сот-медициналық ДНҚ профильдерін жасай алады. ПТР молекулалық биологияның көптеген салаларында кеңінен қолданылады, соның ішінде генотиптеу, гендерді клондау, мутацияны анықтау, ДНҚ ретін анықтау, ДНҚ микромассивтері және әке болуды анықтау.
Кірістірілген ПТР талдаулары дегеніміз не?
Кірістірілген ПТР – ДНҚ-ның спецификалық емес күшейтуін төмендететін ПТР түрі. Кірістірілген ПТР талдауында екі дәйекті ПТР немесе екі дәйекті күшейту реакциясы бар. Бірінші күшейту реакциясы кезінде ПТР өнімі өндіріледі. Бірінші реакциядан кейін бірінші реакцияның ПТР өніміне екінші күшейту реакциясы жүргізіледі. Демек, екінші реакция қоспасындағы праймерлер бірінші ПТР өнімімен байланысып, оны күшейтеді.
02-сурет: кірістірілген ПТР
Праймер жұптары әр реакцияда әртүрлі. Кірістірілген ПТР-да праймерлердің спецификалық емес байланысуы төмендейді. Кірістірілген ПТР талдаулары сезімталдықты және/немесе ерекшелікті арттыру үшін пайдалы. Дегенмен, кірістірілген ПТР мүдделі реттілік туралы білімді қажет етеді.
Нақты уақыттағы ПТР талдаулары дегеніміз не?
Нақты уақыттағы ПТР немесе сандық ПТР (Q ПТР) – ПТР өнімдерін сандық түрде өлшейтін ПТР модификацияланған нұсқасы. Сондықтан бұл әдіс нақты уақыттағы ПТР аппаратын пайдаланып нақты уақытта күшейтуді сандық түрде анықтайды. Бұл сондай-ақ үлгідегі мақсатты реттілік немесе геннің мөлшерін анықтау үшін қолайлы әдіс болып табылады.
Нақты уақыттағы ПТР-ның қызықты ерекшелігі - ол күшейтуді де, шынайы сандық анықтауды да бір қадамға біріктіреді. Сондықтан анықтау үшін гельдік электрофорез қажеттілігін нақты уақыттағы ПТР әдісімен жоюға болады. ПТР реакциялары кезінде ПТР өнімдерін таңбалау үшін флуоресцентті бояғыштарды пайдалану, сайып келгенде, тікелей сандық анықтауға әкеледі. ПТР өнімдері жинақталғанда, флуоресцентті сигналдар да жинақталады және олар нақты уақыттағы машинамен өлшенеді. SYBR Green және Taqman - нақты уақыттағы ПТР күшейту процесін анықтау немесе бақылаудың екі әдісі. Екі әдіс те күшейту процесінің барысын бақылайды және нақты уақытта өнімнің мөлшерін хабарлайды.
03-сурет: нақты уақыттағы ПТР
Нақты уақыттағы ПТР ген экспрессиясын сандық анықтау, микроРНҚ және кодтамайтын РНҚ талдауы, SNP генотиптеу, көшірме санының нұсқаларын анықтау, сирек мутацияларды анықтау, генетикалық түрлендірілген организмдерді анықтау және жұқпалы агенттерді анықтау.
Кәдімгі кірістірілген және нақты уақыттағы ПТР талдауларының қандай ұқсастықтары бар?
- Кірістірілген және нақты уақыттағы ПТР талдаулары әдеттегі ПТР талдауының модификациялары болып табылады.
- Үш әдіс те ДНҚ үлгілерін күшейтеді.
- Олардың өнімдерін реттілікте немесе талдауда пайдалануға болады.
- Бұл талдаулар праймерлерді қажет етеді.
Кәдімгі кірістірілген және нақты уақыттағы ПТР талдауларының айырмашылығы неде?
Кәдімгі ПТР – бұл ДНҚ-ның белгілі бір тізбегін күшейту үшін жасалған әдіс. Сонымен қатар, Nested ПТР – бұл екі дәйекті күшейту реакциясынан тұратын кәдімгі ПТР модификациясы, ал нақты уақыттағы ПТР – күшейтілген өнімнің санын анықтауға қабілетті кәдімгі ПТР нұсқасы. Сонымен, бұл кәдімгі кірістірілген және нақты уақыттағы ПТР талдауларының негізгі айырмашылығы. Кәдімгі және нақты уақыттағы ПТР-дан айырмашылығы, кірістірілген ПТР екі праймер жиынтығын пайдаланады. Сонымен қатар, спецификалық емес күшейтуді азайту үшін кірістірілген ПТР-де екі дәйекті күшейту реакциясы бар. сонымен қатар әдеттегі және нақты уақыттағы ПТР талдауларында екі дәйекті күшейту реакциясы жоқ.
Келесі инфографика қатар салыстыру үшін кестелік түрдегі кәдімгі кірістірілген және нақты уақыттағы ПТР талдауларының арасындағы айырмашылықтарды тізімдейді.
Қорытынды – кәдімгі және кірістірілген және нақты уақыттағы ПТР талдаулары
Кәдімгі ПТР – ДНҚ-ның арнайы фрагменттерін күшейту үшін жасалған бірінші әдіс. Кірістірілген ПТР және нақты уақыттағы ПТР кәдімгі ПТР екі нұсқасы болып табылады. Екі ретті күшейту реакциясы және кірістірілген ПТР-да екі праймер жиынтығын пайдалану бар. Нақты уақыттағы ПТР күшейтілген ПТР өнімінің санын анықтау үшін әзірленген. Осылайша, бұл кәдімгі кірістірілген және нақты уақыттағы ПТР талдауларының арасындағы айырмашылықты қорытындылайды.
